英文标题

KatharoSeqEnablesHigh-ThroughputMicrobiomeAnalysisfromLow-BiomassSamples

中文标题

KatharoSeq——一种能够对低生物量样品进行高通量基因组分析的技术

期刊年份

mSystems,年5月/6月

作者

JeremiahJ.Minich,斯克里普斯海洋研究所

通讯作者

RobKnight,加州大学圣地亚哥分校

各种室内、室外和宿主相关的环境中包含少量的微生物量，并且由于技术上的限制，通常对此类环境微生物的研究不足。研究者只能采用低通量的方法对低生物量微生物组样本的研究，但是研究结果中都存在着错误的结果，而造成这些错误结果的原因通常是在取样过程中得到的假阳性信号。由于常用的DNA提取和扩增试剂盒被微量的微生物DNA污染，因此，要确定低生物量样品中的扩增子产物是否真正能够代表环境时，添加阳性对照至关重要。作者在研究了各种低生物量的试剂盒和方法后，提出了一种新的自动化工作平台——KatharoSeq。

KatharoSeq是什么？

KatharoSeq(来自希腊的katharos，意为清洁或纯净)，具有高灵敏度和低污染的特性，研究在低微生物生物量环境下存活的少数微生物的性质和分布。KatharoSeq由现成的商用高通量DNA提取技术构成，在DNA提取和文库构建时进行阳性和阴性对照滴定评估细胞数量和污染情况，并且结合一个集成的生物信息学平台计算和排除样本，是一种扩增子测序和鸟枪宏基因组兼容的方法。图1为KatharoSeq操作过程。

图1KatharoSeq操作过程

取样：不带入任何人为污染，严格避免取样过程人类皮肤的暴露。

DNA提取：比较了几种商业高通量DNA提取试剂盒，MobioPowerMag表现优良，并且具有 的检测限度（本文 检测限度为5cells），因此被选择为KatharoSeq的DNA提取步骤（图2b）。DNA阳性对照由B.subtilis构成，四组细胞数量分别为5、50、和0。

①在超净台内对样本进行操作，包括已知定量细胞的阳性和阴性对照，分别为8个和4个；

②用MobioPowermag试剂盒经EpMotionrobot裂解细胞；

③KingFisherFlexDNA纯化。

PCR：阳性对照由0.1-基因组拷贝数水平的V.fischeri组成。

①5ulDNA底物在25ulPCR反应体系进行三个重复，包括24-48个PCR阳性对照和8个阴性对照；

②相同的三个重复PCR产物混合；

③PicoGreen定量，评估质量和数量；

④每一样品分别控制混合在质量50ng或体积20ul，所有对照体积为20ul；

⑤纯化PCR产物和IlluminaMiSeq测序（PE2×bp）。

数据分析

低生物量微生物组分析的挑战之一是确定如何排除样本，在此用deblur对序列分析，将样本排除指定为reads0个细胞阳性对照产生reads的中位数（图3a）；后续用其他工具进行群落分析。

图2低生物量微生物组评估

为了证明使用KatharoSeq进行大规模、低生物量宏基因组分析的可行性和实用性，研究人员把此方法应用于三个独特的低生物量环境，包括空间飞行器装配设备（SAF）、新生儿加护病房（NICU）和濒危鲍鱼饲养设施。扩增子测序总共有个样本产生个reads，代表个sOTUs（sub-OTUs）。同时也对SAF96个、NICU个和鲍鱼饲养设施的个样本进行鸟枪宏基因组分析。

研究1：JPLSAF

KatharoSeq发现了一种SAF特有的微生物群落，具有独特的可解释的空间分布(图3)。

与PCR阳性对照的一个sOTU相比，SAF地板样本中32个sOTU的含量差异显著(图3d)。在这32个与SAF相关的sOTUs中，有4个与人类高出现频率呈正相关，包括A.lwoffii,Enterobacteriaceae,Caulobacteraceae和Novosphingobiumsp.(图3e)。其中A.lwoffiisOTU同时出现在JPL阴性对照和PCR阳性对照，这一结果是由于少量污染造成（图3d）。当被映射到JPLSAF的二维布局上时，A.lwoffii的组成在右上角和中间顶部相对较低（图3f）。这一空间格局与Bate多样性分析群落整体空间关系极度相似（图3c），揭示了部分微生物组成与人类活动有关。

针对鸟枪宏基因组分析，在50个JPL地面样本中，29个(58%)包含小于1%的人类序列，17个(34%)包含1-10%的人类序列。对至少10,个处理序列进行分类分析，发现Acinetobacter的丰度很高，虽然没有发现A.lwoffii（数据库中没有其基因组），但是直接与参考基因组的比对证实了它的存在。

在KatharoSeq操作时谨慎选择阳性对照，才能对洁净空间（cleanroom）微生物的识别产生信心，并同时控制试剂盒和样品处理时的污染问题。通过实现空间上不同样本之间物种水平的分辨和比较，我们可医院环境中菌株的来源，设计出消除这些微生物的系统。

图3KatharoSeq应用于JPLSAF

研究2：SAF与其他两个低生物量环境比较

研究者提供了SAF数据与NICU和abalone-饲养设施数据的简要比较，以描述KatharoSeq在一系列低生物量环境和相互关联方面的效用（图4）。

在三种构建的环境中，鲍鱼饲养设施微生物多样性是 的，其次是NICU，然后是SAF(图4a)在这三种环境中，人类的出现与微生物分类群的丰富性有关，例如地面样本，因为与人类直接接触，始终具有 的多样性（图4a）。通过16SrRNA分析(图4c)和鸟枪宏基因组测序(图4d)可以看出，在不同的低生物量环境中，微生物群落组成是不同的。

根据微生物空间分布，最丰富的洁净空间污染物A.lwoffii与人类行走活动有关。在NICU，我们能够区分与患者传染病有关的环境风险，发现的与皮肤有关的微生物是来自医务人员或新生儿父母。在NICU医院感染和败血症有关的人类病原体——S.marcescens，表明KatharoSeq在生物监测中的实用性。在鲍鱼饲养设施中，微生物群落来自水体和动物本身，反映的是海洋环境，而不是人类引入的微生物，因此，应该进行进一步的研究来阐明这些物种在鲍鱼体内的共生或致病作用。所以确定了鲍鱼特殊的微生物群落，发现它们与环境共享一个大的核心类群，未来的研究应该







































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